Клітинна інженерія
Клітинна інженерія рослин
Основним завданням клітинної інженерії є конструювання нових форм рослин з бажаними ознаками. Перспективний метод отримання дальнеродственних гібридів ґрунтується на новій експериментальній техніці - парасексуальними гібридизації, здійснюваної шляхом злиття протопластів. Дослідження по соматичної гібридизації, здійснюваної шляхом злиття протопластів. Дослідження по соматичної гібридизації рослин йдуть за трьома основними напрямками:
- вивчення та реконструкція плазмагенов (генетичний матеріал, локалізований поза ядра);
- дослідження по гібридизації клітин філогенетично віддалених видів рослин;
- отримання за допомогою злиття протопластів соматичних гібридів, які представляють практичний інтерес для селекції.
Основні відмінності соматичної гібридизації від статевого схрещування полягають в наступному. По-перше, за допомогою статевої гібридизації можуть схрещуватися тільки рослинні форми з нормальним морфогенезом і гаметогенезу. Презіготіческую несумісність можна подолати за допомогою методу злиття протопластів. По-друге, статевої процес симетричний, тобто гамети привносять в зиготу рівні набори ядерного генетичного матеріалу від обох батьків. Продукти ж злиття протопластів часто є асиметричними гібридами, що представляють цінні форми, що містять весь хромосомний набір культурного виду і лише кілька хромосом або генів дикого батька. По-третє, внеядерная генетичний матеріал у більшості рослин при статевому схрещуванні успадковується строго однородітельскі - по материнській лінії. Злиття протопластів дозволяє отримувати унікальні поєднання мітохондріальних і хлоропластних генів. І, нарешті, четверте відмінність полягає в тому, що статева гібридизація можлива тільки між філогенетично близькими видами рослин. При соматичної гібридизації можливе отримання гібридів філогенетично віддалених форм, які звичайним шляхом схрестити неможливо.
Злиття протопластів починається з встановлення контакту (адгезії) між празмалеммамі сусідніх протопластов. Одночасно відбувається зміна властивостей мембран, що призводять до їх злиття. Розширення локальних цитоплазматических містків призводить до об`єднання цитоплазм з утворенням гібридних клітин - цибрідов.
Для формування з гібридних протопластов рослин, протопласти необхідно культивувати, щоб вони могли ділитися і утворювати каллус, з якого згодом може регенерувати цілу рослину. Зростає кількість видів, для яких вдалося провести весь цикл "Рослина - Протопласти - Каллус - Рослина".
Одним з найважливіших моментів при проведенні соматичної гібридизації є відділення утворилися гібридних клітин від батьківських. Селекція парасексуальних гібридів може проводитися або на клітинному рівні, або на стадії регенерації рослин. Селекція на стадії регенерації рослин має ряд істотних недоліків, що ускладнюють такий відбір: 1) немає впевненості, що все гібридні рослини не є нащадками єдиною гібридної клітини-2) тривалий час, необхідний для селекції регенерантов- 3) велика трудомісткість. У зв`язку з цим, розробляються методи відбору соматичних гібридів на клітинному рівні. Найбільш поширеними є методи: 1) механічної ізоляціі- 2) генетичної комплементаціі- 3) фізіологічної комплементаціі- 4) фізичного збагачення.
Відео: Наука 2.0. Рогівка. клітинна інженерія
У популяції рослинних клітин in vitro після їх злиття можуть мати місце різні небажані генетичні зміни (поліплоїдія, хромосомні перебудови, різні мутації), що призводять до появи форм, фенотипически схожих з гібридними. Крім того, агрегація вихідних батьківських клітин може призвести до утворення химерних тканин (рослин). У зв`язку з цим, відібрані форми соматичних гібридів повинні піддаватися додатковим аналізам для перевірки їх гибридности. Гибридологический аналіз дозволяє проводити оцінку потомства F1 після самозапилення. Цитогенетичний аналіз заснований на вивченні числа і морфології хромосом гібридних і батьківських клітин. Більш інформативний метод диференціального фарбування хромосом. Цитогенетичний аналіз найбільш доказовий для дальнеродственних комбінацій - межсемейственних і межтрібних.
Визначення ферментативної активності і вивчення спектру ізоферментів дозволяє виявити гібридну природу досліджуваного матеріалу. При цьому в спектрах ізоферментів гібрида повинні поєднуватися зони, характерні для кожного з батьків. Велике значення має фізіологічна стабільність різних форм ізоферментів залежно від диференціювання використовуваних для аналізу клітин.
Аналіз білка "Фракція 1". Цей білок локалізований в хлоропластах і являє собою фермент рибулозо-1,5-діфосфаткарбоксілазу з оксігеназной активністю і складається з великої і малої субодиниць. Поліпептидний складу обох субодиниць різний у різних видів рослин, тому цей білок є маркером при вивченні меджвідових гібридів. Мала субодиниця кодується ядерним геномом і успадковується двобатьківського. Велика субодиниця успадковується однородітельскі (материнськи) і кодується пластому. Аналіз білка дозволяє отримати доказ гибридности матеріалу і виключити хімерізм.
Рестріктний аналіз ДНК органел. Аналіз ДНК органел за допомогою рестриктаз є швидким і точним методом визначення гибридности по цітоплазмону. Рестріктние спектри, одержувані в результаті електрофорезу відоспецефічни і можуть бути використані для характеристики ДНК органел.
Молекулярна гібридизація нуклеїнових кислот. Застосовують як ДНК-ДНК, так і ДНК-РНК-гібридизації. Ступінь молекулярної гібрідізуемості використовується для характеристики систематичного і філогенетичного споріднення видів. Метод молекулярної гібридизації перспективний при вивченні природи парасексуальних гібридів, особливо гібридів філогенетично віддалених видів. У разі, коли хромосомний аналіз не в змозі виявити наявність в клітинах гібридів хромосомного матеріалу одного з батьків, найбільш підходящим методом для аналізу гібридів є саме метод молекулярної гібридизації нуклеїнових кислот.
Фенотипическая мінливість, яка спостерігається у соматичних гібридів, є відображенням тих генетичних явищ, які відбуваються до регенерації і вказують на наступні 4 джерела мінливості: 1) ядерна несовместімость- 2) межгеномная митотическая рекомбінація- 3) сомаклональної ізменчівость- 4) органоїдну розщеплення.
Існують наступні обмеження, що заважають повному успіху методу соматичної гібридизації: 1) застосування цього методу вимагає ефективної регенерації рослин з протопластов- 2) соматичні гібриди не піддаються статевого розмноження, все міжвидові соматичні гібриди є стерільнимі- 3) для того, щоб перенести корисні гени з диких видів в культурні, необхідно здійснити межгеномную рекомбінацію або хромосомні заміщення між двома відамі- 4) при злитті протопластів виходять рослини з підсумовування им числом хромосом. Однак швидкий прогрес в удосконаленні методів клітинної інженерії дозволяє сподіватися, що соматична гібридизація як нова біотехнологія стане основною в селекції для отримання життєздатних гібридів нескрещівающіхся видів рослин.
Реконструкція клітини є ще одним бурхливо розвиваються напрямком клітинної інженерії. Йдеться про збірку абсолютно нової клітини за рахунок об`єднання (злиття) ізольованих клітинних фрагментів один з одним або з цілими клітинами. В результаті такої реконструкції можна створити клітину, раніше в природі не існувала. Однак багато проблем, які стоять на шляху досліджень в даному напрямку, пов`язані з обмеженим числом відповідних методик фрагментації і виділення гомогенних популяцій інтактних клітинних фрагментів.
Відео: Генна інженерія
Існує ряд методик по введенню чужорідних хлоропластів в ізольовані протопласти. Одна з методик передбачає послідовне центрифугування протопластов і пластид в 0,03% розчині лізоциму, який має модифицирующим дією на мембрану. Частота проникнення чужорідних органел в протопласти в даному випадку становить 0,5%. Інший метод полягає в тому, що ізольовані поодинокі клітини інкубують з ферментом целюлазою. Після появи перших протопластов клітини переносять в суспензію хлоропластів в 2% розчині целюлази і 0,2 М NaNo3прі рН 5,4 .. За допомогою цього методу проведено успішне включення в протопласти функціонально активних хлоропластів з подальшою регенерацією цілих рослин. Здійснено пересадку пластид чорного пасльону, несуть гени, які контролюють стійкість до атразин, культурному картоплі. Аналіз хлоропластної ДНК стійких до атразин рослин-регенерантів картоплі показав, що хлоропласти цих ліній походять від пасльону.
Перенесення високоефективних хлоропластів може сприяти активації фотосинтезу і підвищенню продуктивності рослин. Серед великої різноманітності генетично змінених форм рослин, що утворилися з протопластів, що злилися, зустрічаються форми, що містять пластиди одного з батьків, а мітохондрії іншого, і навпаки.
Новим напрямком клітинної інженерії рослин є створення незвичайних біологічних систем шляхом введення микрорганизмов в популяцію культивованих клітин. Створення таких асоціацій становить інтерес для вирішення наступних завдань: 1) експериментальної перевірки теорії ендосімбіотіческого походження еукаріотичної клітини в процесі еволюціі- 2) моделювання природних симбіотичних відносин рослин мікроорганізмів-3) підвищення продуктивності культивованих рослинних клітин 4) отримання рослин з новими властивостями-5) вивчення різних аспектів взаємодії рослини-господаря і патогена.
Отримання штучних асоціацій міжклітинної і внутрішньоклітинного типу на основі культивованих клітин або ізольованих протопластів з мікроорганізмами є одним з нових способів модифікації рослинної клітини. Досить перспективним є отримання асоціацій культур клітин рослин з мікроорганізмами, здатними до фіксації молекулярного азоту атмосфери. Здатність до формування азотфіксуючих симбіотичних систем придбали певні групи вищих рослин і мікроорганізмів. У зв`язку з цим питання про підвищення здатності до вступу в такі симбіотичні асоціації для більшості рослин має важливе економічні значення і може бути вирішене методами клітинної інженерії.
Отже, стає можливим конструювання клітин з новими властивостями. Реконструйовані клітини, що походять з ядра і цитоплазми різного походження, є зручними експериментальними моделями для вирішення таких важливих біологічних проблем, як диференціювання, старіння клітин, цитоплазматическая спадковість. Гібриди рослин з генетично реконструйованої цитоплазмой представляють собою дуже цінний матеріал для оцінки впливу двох цитоплазматичних генофором на різні практично значимі ознаки вирощуваних культур.
